教你如何選擇融合蛋白接頭Linker

融合蛋白在分(fēn)子生物(wù)學中的(de)應用(yòng)極爲廣泛，最簡單的(de)應用(yòng)是在蛋白質的(de)末端連上标簽，用(yòng)于WB檢測或純化(huà)。複雜(zá)一些的(de)應用(yòng)則是将需要研究的(de)目的(de)蛋白與另一個(gè)标記蛋白連接：當标記蛋白爲熒光(guāng)蛋白時(shí)，可(kě)将目的(de)蛋白的(de)示蹤和(hé)圖像學分(fēn)析；标記蛋白爲白蛋白或者抗體Fc片段時(shí)，可(kě)用(yòng)于延長(cháng)目的(de)蛋白的(de)半衰期；又或者将兩個(gè)目的(de)蛋白連接，用(yòng)于研究他(tā)們的(de)共同功能或者相互作用(yòng)。

作爲需要使用(yòng)融合蛋白的(de)科研工作者，了(le)解一些必要的(de)Linker知識，将使得(de)您在設計質粒方面更加得(de)心應手。本文将介紹一下(xià)天然形式下(xià)的(de)蛋白Linker和(hé)目前應用(yòng)最廣泛的(de)人(rén)工合成Linker，以及他(tā)們的(de)特性；其次介紹通(tōng)過增加蛋白Linker實現的(de)各種功能，包括提高(gāo)折疊和(hé)穩定性，促進蛋白質表達，增加内在生物(wù)學活性；最後介紹如何使用(yòng)在線工具設計Linker。

我們通(tōng)常将使用(yòng)的(de)蛋白Linker分(fēn)爲3種，分(fēn)别爲柔性Linker、剛性Linker以及可(kě)剪切（或自剪切）Linker。

  

柔性Linker

最常見的(de)柔性Linker就是G（Gly）甘氨酸和(hé)S（Ser）絲氨酸的(de)GS組合，最常用(yòng)的(de)GS組合就是(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n，通(tōng)過改變n的(de)大(dà)小，研究者可(kě)以将結構域之間的(de)距離放大(dà)和(hé)減小，實現結構域分(fēn)離（n≥2）或連接結構域，研究其相互作用(yòng)。

其他(tā)一些常見的(de)蛋白Linker具有一些特定的(de)用(yòng)途，例如單鏈可(kě)變片段（single chain variable fragment (scFv)）中，連接重鏈可(kě)變區(qū)（VH）和(hé)輕鏈可(kě)變區(qū)（VL）的(de)柔性Linker，通(tōng)常爲KESGSVSSEQLAQFRSLD和(hé) EGKSSGSGSESKST。這(zhè)些序列中甘氨酸（Gly）和(hé)絲氨酸（Ser）提供柔軟度，谷氨酸（Glu）和(hé)賴氨酸（Lys）提高(gāo)水(shuǐ)溶性。

更簡單粗暴一些的(de)柔性Linker就是純甘氨酸（Gly）組成的(de)(Gly)8，或短一點點的(de)(Gly)6，它們的(de)優點是在酵母表達純化(huà)過程中，能夠抵抗蛋白酶的(de)水(shuǐ)解，同時(shí)保護兩端蛋白結構域的(de)功能活性。

 

剛性Linker

具有(EAAAK)n序列的(de)α-螺旋形成的(de)Linker具有内部氫鍵和(hé)密切聯系肽鏈骨幹，剛性且穩定。因此，剛性α-螺旋Linker可(kě)作爲蛋白質結構域之間的(de)剛性間隔。通(tōng)過将藍色熒光(guāng)蛋白（EBFP）和(hé)綠(lǜ)色熒光(guāng)蛋白（EGFP）連接在一起，評估熒光(guāng)共振能量轉移（FRET）之間的(de)效率，可(kě)以發現(EAAAK)n序列連接兩個(gè)熒光(guāng)蛋白時(shí)，熒光(guāng)共振能量轉移效率比(GGGGS)n序列低，說明(míng)α-螺旋Linker能夠有效的(de)隔離兩個(gè)不同的(de)蛋白結構域。

另一種類型的(de)剛性Linker具有Pro-rich序列(XP)n，其中X可(kě)指定任何氨基酸，推薦選擇丙氨酸（Ala），賴氨酸（Lys）或谷氨酸（Glu）。(XP)n序列沒有螺旋結構，Linker中存在的(de)脯氨酸（Pro）可(kě)以增加骨架硬度，并且有效分(fēn)離結構域。富含脯氨酸序列的(de)結構在機體中廣泛的(de)存在，例如骨骼肌蛋白的(de)N端就存在(Ala-Pro)7的(de)結構。

剛性Linker表現出相對(duì)堅硬的(de)結構，能夠有效的(de)将兩端的(de)蛋白結構域分(fēn)開，通(tōng)過改變n的(de)大(dà)小，就能夠輕易調整結構域之間的(de)最佳距離，從而保證兩端蛋白的(de)活性與生物(wù)功能。

 

可(kě)剪切Linker

到目前爲止討(tǎo)論的(de)Linker通(tōng)常不會在體内裂解。這(zhè)些穩定的(de)接頭共價連接兩個(gè)功能域，使得(de)融合蛋白在體内變成一個(gè)蛋白。功能結構域之間的(de)穩定連接提供許多(duō)優點，例如延長(cháng)的(de)血漿半衰期（例如白蛋白或Fc融合）。然而，它也(yě)有一些潛在的(de)缺點，包括功能域之間的(de)空間位阻，生物(wù)活性降低，以及由于域之間的(de)幹擾導緻蛋白質部分(fēn)的(de)生物(wù)分(fēn)布和(hé)代謝方式改變。在這(zhè)些情況下(xià)，引入可(kě)剪切Linker，使得(de)融合蛋白能夠在體内釋放，分(fēn)離兩個(gè)功能結構域。

一個(gè)研究的(de)比較透徹的(de)過程是二硫鍵的(de)還(hái)原。這(zhè)個(gè)可(kě)剪切Linker序列爲LEAGCKNFFPR↓SFTSCGSLE，基于二硫環肽，在接頭上的(de)兩個(gè)半胱氨酸（Cys）殘基之間形成的(de)分(fēn)子内二硫鍵，同時(shí)這(zhè)個(gè)序列對(duì)凝血酶敏感。在凝血酶的(de)作用(yòng)下(xià)能夠有效的(de)對(duì)Linker中凝血酶敏感序列（PRS）進行切割。

其他(tā)比較流行的(de)可(kě)剪切Linker，能夠不依賴蛋白酶，自行進行切割處理(lǐ)，使得(de)兩個(gè)結構域斷裂。這(zhè)些自剪切Linker通(tōng)爲2A短肽，通(tōng)常在序列NPG↓P進行自剪切分(fēn)離。2A短肽通(tōng)常來(lái)源于病毒的(de)蛋白質序列，例如P2A表示來(lái)源于豬捷申病毒（porcine teschovirus-1）；E2A表示來(lái)源于馬鼻炎病毒（equine rhinitis A virus）；F2A表示來(lái)源于口蹄疫病毒（Footand Mouth Disease Virus）。由于自剪切效率各有不同，2A短肽之間也(yě)存在一定差異，我們一般推薦使用(yòng)P2A或T2A序列。

如何設計Linker

随著(zhe)對(duì)天然多(duō)結構域蛋白中的(de)Linker和(hé)重組融合蛋白的(de)廣泛研究，研究者們萌生了(le)構建數據庫的(de)想法，提出了(le)Linker設計工具，基于融合蛋白的(de)期望特性來(lái)合理(lǐ)設計Linker。這(zhè)種類型的(de)工具的(de)一個(gè)典型例子是名爲synlinker的(de)程序，該程序在用(yòng)戶指定的(de)輸入（例如Linker長(cháng)度，要避免的(de)蛋白酶敏感序列）中搜索其連接子序列的(de)數據庫，并生成幾個(gè)連接子序列的(de)輸出。Linker數據庫是基于這(zhè)樣的(de)假設建立的(de)，即在X射線晶體結構或NMR溶液結構中觀察到的(de)環序列可(kě)能采用(yòng)延伸構象作爲融合蛋白中的(de)Linker。最終的(de)數據庫包含14,734個(gè)序列，它們包含PDB文件中的(de)記錄，可(kě)自動識别蛋白質的(de)二級和(hé)環狀結構。程序的(de)基本輸入是Linker序列的(de)期望長(cháng)度，通(tōng)常表示爲殘基數量或以埃爲單位的(de)距離。額外的(de)輸入參數包括，避免被蛋白酶或限制性内切酶切割，使得(de)選擇的(de)Linker在克隆過程中對(duì)特定蛋白酶穩定或序列對(duì)限制性内切酶具有抗性。使用(yòng)者還(hái)可(kě)以加入氨基酸組成偏好（例如，消除疏水(shuǐ)性殘基）以進一步選擇其感興趣的(de)Linker。此程序可(kě)以作爲生成Linker序列的(de)工具，使用(yòng)十分(fēn)便利（http://synlinker.syncti.org/）。

不過，如果您覺得(de)設計Linker有些麻煩，構建質粒也(yě)無從下(xià)手，且耗時(shí)費力，那麽把這(zhè)些工作交給專業的(de)科研服務供應商不失爲一個(gè)便捷、高(gāo)效的(de)選擇。默賽爾生物(wù)公司專業提供質粒構建服務，協助您量身定制科研計劃。默賽爾生物(wù)公司憑借在分(fēn)子生物(wù)學領域積累的(de)豐富的(de)工作經驗，可(kě)根據已有載體進行各種改造方案的(de)設計，我們的(de)服務内容有：

1. 設計引物(wù)，從克隆載體（或基因組、cDNA模闆）上擴增目的(de)基因片段。

2. 處理(lǐ)載體，進行目的(de)基因與載體的(de)連接。

3. 轉化(huà)連接目的(de)基因的(de)載體，并轉化(huà)感受态，鑒定陽性質粒。

4. 對(duì)連接目的(de)基因的(de)載體進行DNA測序。

5. 将陽性質粒保存菌種，質粒和(hé)測序報告提交給客戶。

6. 針對(duì)客戶要求對(duì)現有質粒結構進行改造。

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參考文獻

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[2] Effect oflinker flexibility and length on the functionality of a cytotoxic engineeredantibody fragment. J. Biotechnol. 2015. 199: 90-97.

[3] High cleavageefficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human celllines, zebrafish and mice. PLoS One. 2011; 6(4):e18556. doi:10.1371/journal.pone.0018556. Epub 2011 Apr 29.