一、服務概述
        Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats（CRISPR）是細菌和(hé)古細菌爲應對(duì)病毒和(hé)質粒不斷攻擊而演化(huà)來(lái)的(de)獲得(de)性免疫防禦機制，其中II型CRISPR/Cas免疫系統依賴Cas9内切酶家族能夠靶向和(hé)剪切外源DNA，是目前使用(yòng)最廣泛的(de)CRISPR/Cas9系統。
        相對(duì)ZNF&TALEN編輯技術，作爲第三代基因編輯技術——CRISPR/Cas9系統具有顯著優勢。首先，載體構建簡單且靶向效率高(gāo)，隻需要構建20堿基的(de)CRISPR gRNA即可(kě)與DNA序列進行匹配，從而介導Cas9蛋白對(duì)DNA序列進行切割；其次，CRISPR-Cas9可(kě)編輯的(de)位點分(fēn)布頻(pín)率較高(gāo)，易選擇合适的(de)位點進行基因編輯；最重要的(de)是，CRISPR-Cas9可(kě)同時(shí)對(duì)基因組進行多(duō)位點編輯。CRISPR/Cas9系統因其系統成分(fēn)簡單、操作方便、突變效率高(gāo)、成本低廉的(de)優點，已成爲現在發展最爲迅速、國内外學者廣泛研究開發、應用(yòng)于多(duō)種生物(wù)體基因組的(de)定向基因編輯技術。
        CRISPR/Cas9技術主要由兩個(gè)組成部分(fēn)：内切核酸酶蛋白（endonuclease）和(hé)一段引導RNA（guide RNA，gRNA）。内切核酸酶是來(lái)源于化(huà)膿性鏈球菌的(de)Cas9核酸酶蛋白。 Cas9核酸酶具有切割雙鏈DNA的(de)兩個(gè)DNA切割結構域（RuvC1和(hé)HNH樣核酸酶結構域），能夠使DNA雙鏈斷裂。gRNA是改造後的(de)單鏈嵌合RNA，将細菌tracrRNA的(de)支架功能與細菌crRNA的(de)特異性相結合。gRNA 5'末端的(de)最後20bp作爲靶向序列，通(tōng)過RNA-DNA堿基配對(duì)将Cas9 / gRNA複合物(wù)特異性結合至基因組DNA靶點，位于基因組DNA間隔區(qū)相鄰基序（PAM）的(de)上遊（圖1）。

圖1 CRISPR/Cas9基因敲除示意圖

        不同菌株類型的(de)CRISPR/Cas蛋白識别的(de)PAM序列有所區(qū)别，化(huà)膿性鏈球菌Cas9的(de)序列是5'-NGG。因此，我們所用(yòng)的(de)經過改造的(de)CRISPR/Cas9系統，可(kě)以針對(duì)任何5'-N20-NGG DNA序列并産生精确的(de)雙鏈斷裂。然後通(tōng)過細胞生物(wù)學中通(tōng)用(yòng)的(de)DNA修複機制——非同源末端連接（NHEJ）或同源定向修複（HDR），來(lái)修複雙鏈斷裂的(de)基因組DNA（圖2）。在修複過程中會産生一定數目的(de)堿基缺失突變或堿基插入突變，而這(zhè)些插入和(hé)缺失會造成基因的(de)外顯子閱讀框的(de)移碼或提前引入終止密碼子，導緻無法轉錄爲正确mRNA，沉默gRNA結合的(de)靶基因。

圖2 CRISPR/Cas9系統沉默靶基因機制示意圖

 
二、服務内容
1. 設計gRNA靶向序列。
2. 構建含有gRNA的(de)CRISPR/Cas9敲除質粒，測序驗證産物(wù)。
3. 利用(yòng)構建完成的(de)CRISPR/Cas9敲除質粒，包裝慢(màn)病毒并測定滴度。
4. 篩選獲得(de)的(de)基因敲除細胞株進行T7E1驗證。
5. 基因敲除細胞單克隆化(huà)，擴大(dà)培養後進行測序鑒定相應克隆，确認存在雙等位基因敲除。
6. 基因敲除細胞Western檢測驗證。
 
三、技術優勢
1. 技術新：基于最新的(de)CRISPR/Cas9技術，有效敲除目的(de)基因并避免脫靶效應。
2. 标準嚴：可(kě)以提供經過T7E1法驗證的(de)慢(màn)病毒或細胞株，也(yě)可(kě)以提供經過Western blot驗證的(de)多(duō)克隆細胞株。
3. 篩選快(kuài)：基于CRISPR/Cas9技術的(de)sgRNA快(kuài)速篩選和(hé)驗證體系，可(kě)以在最短的(de)時(shí)間内完成sgRNA的(de)篩選和(hé)T7E1法驗證。
4. 時(shí)間短：目的(de)基因敲除的(de)多(duō)克隆細胞株僅需5-6周即可(kě)完成；單克隆細胞株一般在9-10周完成。
 
四、服務提供圖片（以MSTN基因敲除爲例）
（1）gRNA靶向序列位置及相關參數。

圖3 MSTN基因gRNA序列（黑(hēi)體）及PAM序列（下(xià)劃線）

（2）構建完成的(de)質粒圖譜。

圖4 質粒構建過程

圖5 構建完成的(de)MSTN基因CRISPR/Cas9敲除質粒圖譜

（3）篩選細胞株T7E1驗證結果
對(duì)敲除基因後的(de)細胞的(de)PCR産物(wù)進行變性和(hé)退火處理(lǐ)後加入T7E1 (核酸内切酶，隻切割堿基錯配的(de)DNA)，經T7E1消化(huà)後可(kě)見明(míng)顯的(de)切割條帶，說明(míng)預期的(de)敲除位點附近存在大(dà)量gRNA引導Cas9切割形成的(de)缺失突變。

圖6 MSTN基因敲除細胞株T7E1驗證結果

（4）基因敲除細胞單克隆測序驗證結果。

圖7 MSTN基因敲除細胞株單克隆測序結果。

（5）基因敲除細胞Western檢測驗證結果
        篩選獲得(de)的(de)陽性細胞傳代2次後，取細胞制備蛋白樣品，每孔的(de)蛋白上樣量爲20-40μg。用(yòng)GAPDH作爲内參，用(yòng)抗MSTN的(de)抗體檢測細胞中MSTN蛋白表達情況。

圖8 MSTN基因敲除細胞中MSTN蛋白Western檢測結果

 
五、服務價格及周期

服務編号服務項目價格服務周期
RS002-1構建CRISPR/Cas9敲除質粒，并完成測序驗證
2周
RS002-2包裝慢(màn)病毒，并完成測定滴度驗證
2周
RS002-3陽性細胞篩選，并完成T7E1驗證
1周
RS002-4單克隆化(huà)陽性細胞，并完成測序驗證
3-4周
RS002-5基因敲除細胞Western檢測驗證
2-3周
RS002-6CRISPR/Cas9基因敲除用(yòng)慢(màn)病毒(無T7E1驗證)
3-4周
RS002-7CRISPR/Cas9基因敲除用(yòng)慢(màn)病毒(T7E1驗證)
3-4周
RS002-8CRISPR/Cas9基因敲除多(duō)克隆細胞株(T7E1驗證)
5-6周
RS002-9CRISPR/Cas9基因敲除多(duō)克隆細胞株(T7E1驗證、WB驗證)
6-7周
RS002-10CRISPR/Cas9基因敲除單克隆細胞株(單等位基因敲除)
9-10周
RS002-11CRISPR/Cas9基因敲除單克隆細胞株(雙等位基因敲除)
9-10周
RS002-12敲除用(yòng)慢(màn)病毒與敲除多(duō)克隆細胞株
5-6周
RS002-13相同基因敲除用(yòng)慢(màn)病毒再次訂購(gòu)
1-2周
RS002-14相同基因敲除多(duō)克隆或單克隆細胞株再次訂購(gòu)
1-2周
RS002-15相同基因敲除的(de)不同多(duō)克隆細胞株(T7E1驗證)
5-6周
RS002-16相同基因敲除的(de)不同多(duō)克隆細胞株(T7E1驗證、WB驗證)
5-6周
RS002-17相同基因敲除的(de)不同單克隆細胞株(單等位基因敲除)
9-10周
RS002-18相同基因敲除的(de)不同單克隆細胞株(雙等位基因敲除)
9-10周
RS002-19其它CRISPR/Cas9相關技術服務詢價

 

 
六、CRISPR/Cas9技術服務流程
1. 用(yòng)戶下(xià)載并填寫CRISPR/Cas9技術服務協議(yì)書(shū)，發送至service@morecell.com.cn。
2.  雙方确認并簽訂技術服務協議(yì)書(shū)，按照(zhào)協議(yì)内容進行技術服務。
 
七、客戶須知
1. 客戶提供需要編輯的(de)目的(de)基因相關信息；
2. 客戶提供需要編輯的(de)細胞株及其相關信息；
3. 客戶需要提供需要編輯目的(de)基因的(de)抗體（如果選做(zuò)western）；
4. 敲除用(yòng)慢(màn)病毒将以幹冰運輸的(de)方式提供；
5. 基因敲除的(de)細胞株将以幹冰運輸或活細胞培養的(de)方式提供。